Un estudio explora el potencial de la lavanda para tratar el estrés y la ansiedad

Publicado: 23 de octubre de 2018.

Editado por:

Alicia Izquierdo , Universidad de California, Los Ángeles, Estados Unidos

Revisado por:

Rosemarie Perry , Universidad de Nueva York, Estados Unidos

Michael Leon , Universidad de California, Irvine, Estados Unidos

Copyright © 2018 Harada, Kashiwadani, Kanmura y Kuwaki. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia de Atribución Creative Commons (CC BY) . Se permite el uso, distribución o reproducción en otros foros, siempre que se cite al autor(es) original(es) y al propietario(s) de los derechos de autor y se cite la publicación original en esta revista, de acuerdo con la práctica académica aceptada. No se permite ningún uso, distribución o reproducción que no cumpla con estos términos.

El doctor Hideki Kashiwadani, de la Universidad japonesa de Kagoshima y uno de los autores del estudio, recuerda en el artículo publicado hoy que la medicina popular lleva mucho tiempo explorando tratamientos para la ansiedad a base de compuestos olorosos derivados de plantas . No ha sucedido lo mismo en la medicina moderna y, a su juicio, ningún estudio anterior había tratado de descifrar el mecanismo que activa el efecto relajante de la lavanda, un paso clave para avanzar hacia su uso clínico en humanos.

Artículo de Investigación Original

Frente. Comportamiento. Neurosci., 23 de octubre de 2018

Sec. Regulación y procesamiento de emociones

Volumen 12 - 2018 | https://doi.org/10.3389/fnbeh.2018.00241

Efectos ansiolíticos inducidos por el olor del linalol en ratones

Hiroki Harada 1,2† Hideki Kashiwadani1*† Yuichi Kanmura2 Tomoyuki Kuwaki1

• 1 Departamento de Fisiología, Escuela de Graduados en Ciencias Médicas y Dentales, Universidad de Kagoshima, Kagoshima, Japón

• 2 Departamento de Anestesiología, Escuela de Graduados en Ciencias Médicas y Dentales, Universidad de Kagoshima, Kagoshima, Japón

En la medicina popular se cree desde hace mucho tiempo que los compuestos olorosos derivados de extractos de plantas pueden tener efectos ansiolíticos. Entre ellos, se ha informado que el linalool, uno de los alcoholes terpénicos en los extractos de lavanda, tiene efectos ansiolíticos. Sin embargo, no se ha examinado en profundidad la naturaleza ansiolítica del olor del linalol ni su posible acción a través del sistema olfativo. En este estudio, examinamos los efectos ansiolíticos del olor a linalol con una prueba de caja clara/oscura y con un laberinto en cruz elevado (EPM), y descubrimos que el olor a linalol tiene un efecto ansiolítico sin deterioro motor en ratones. El efecto no se observó en ratones anósmicos, lo que indica que fue desencadenado por una entrada olfativa provocada por el olor a linalool. Además, el efecto fue antagonizado por flumazenil, lo que indica que el efecto ansiolítico inducido por el olor del linalool fue mediado por la transmisión energética del ácido γ-aminobutírico (GABA) a través de receptores GABA A que responden a las benzodiazepinas (BDZ) . Estos resultados proporcionan información sobre los posibles mecanismos neuronales centrales que subyacen a los efectos ansiolíticos inducidos por el olor y la base para explorar la aplicación clínica del olor de linalool en los tratamientos de la ansiedad.

Introducción

Los trastornos de ansiedad son la clase más frecuente de trastornos mentales. Aproximadamente el 5,3% de los adultos en Japón o el 18,2% de los adultos en los EE. UU. cumplen los criterios de diagnóstico de al menos un trastorno de ansiedad en los últimos 12 meses ( Demyttenaere et al., 2004 ). Debido a estas altas tasas, el desarrollo de terapias y herramientas terapéuticas eficaces para tratar los trastornos de ansiedad es uno de los problemas más urgentes en el campo de las ciencias mentales.

La terapia con fármacos ansiolíticos ha sido durante mucho tiempo una opción de primera línea como opción de tratamiento eficaz para los trastornos de ansiedad ( Hoffman y Mathew, 2008 ). Los fármacos mejor desarrollados y comúnmente recetados para tratar los trastornos de ansiedad son las azapironas y los inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (ISRS), que modulan la transmisión sináptica serotoninérgica, y las benzodiazepinas (BDZ), que modulan el ácido γ-aminobutírico (GABA)érgico ( Ravindran y Stein, 2010 ). Sin embargo, los efectos secundarios (p. ej., retraso del efecto clínico, dolor de cabeza, somnolencia, mareos y síndrome serotoninérgico para las azapironas; retraso del efecto clínico, disfunción sexual y síndrome serotoninérgico para los ISRS; abuso, riesgo de dependencia, amnesia retrógrada y sedación para las BDZ) de estos Las drogas pueden ser graves y más perjudiciales que la ansiedad misma, por lo que aún se espera y es necesario un mayor desarrollo de nuevas drogas ( Nash y Nutt, 2005).

Además de los productos farmacéuticos ansiolíticos, en la medicina tradicional se han utilizado compuestos aromáticos derivados de extractos de plantas como tratamiento para la ansiedad ( Connor y Vaishnavi, 2009 ). Por ejemplo, el extracto de lavanda se ha utilizado para tratar a pacientes que sufren de ansiedad ( Kasper et al., 2010 ). Se informó que varios compuestos extraídos de la lavanda, como el linalool, tienen efectos ansiolíticos ( De Sousa et al., 2015 ). Sin embargo, los mecanismos neuronales que subyacen a los efectos ansiolíticos informados de los compuestos olorosos aún no se han revelado completamente. En el caso del linalol, tampoco se han abordado aún los efectos ansiolíticos del propio olor.

En este estudio, examinamos los efectos ansiolíticos del olor a linalol en ratones. Las pruebas de comportamiento clásicas relacionadas con la ansiedad mostraron que la exposición al olor del linalol inducía efectos ansiolíticos significativos. Los efectos no se observaron en ratones anósmicos, lo que indica que los efectos fueron desencadenados por la entrada olfativa provocada por el olor del linalool. Además, encontramos que flumazenil antagonizaba los efectos ansiolíticos inducidos por el olor del linalol, lo que indica que la transmisión GABAérgica sensible a BDZ desempeña un papel fundamental en los efectos ansiolíticos.

Materiales y métodos

animales

Se utilizaron ratones macho de tipo salvaje (C57BL/6N, 25–35 g, n = 240) comprados originalmente en CLEA Japón (Tokio, Japón) para evitar posibles variaciones relacionadas con el ciclo menstrual en las hembras. Todos los animales se mantuvieron a una temperatura constante (24 ± 1°C) con libre acceso a comida y agua. Los animales se alojaron con luces encendidas a las 7:00 a. m. y apagadas a las 7:00 p. m. Todos los experimentos se realizaron durante el ciclo de luz, entre las 12:00 p. m. y las 5:00 p. m. Los animales no supieron el olor y las drogas del linalool, y cada ratón fue Se utiliza sólo una vez para evitar efectos de arrastre. Los animales se aclimataron durante 3 días con 3 minutos de manipulación cada día. En los días del experimento, los ratones fueron trasladados a la sala del experimento 3 h antes del inicio del experimento. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las pautas descritas por la Sociedad de Fisiología de Japón y fueron aprobados por el Comité de Investigación Experimental con Animales de la Universidad de Kagoshima.

Drogas

Cercine ® (5 mg/mL de diazepam (modulador alostérico positivo para los receptores A del ácido γ-aminobutírico (GABA A Rs) con sitio de unión BDZ, 1,5 mg/kg ip; Takeda Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japón)), flumazenil (antagonista selectivo para el sitio BDZ de GABA A Rs 3 mg/kg ip) y WAY100635 (antagonista del receptor de serotonina 1A (5-HT 1A R), 0,5 mg/kg ip; Tocris Bioscience, Boston, MO, EE. UU.). El diazepam se diluyó con NaCl al 0,9%. Se disolvieron flumazenil y WAY100635 en Tween80 y se diluyeron con NaCl al 0,9% (la concentración final de Tween80 fue del 2%). Todos los fármacos y el vehículo (Tween80 al 2% en NaCl al 0,9%) se inyectaron por vía intraperitoneal 30 minutos antes de las pruebas de comportamiento. El linalool se compró en Tokyo Chemical Industry. Se inyectó por vía intraperitoneal 3-metilindol (3-MI; 300 mg/kg ip; Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) para la privación del epitelio olfatorio. Se utilizó aceite de maíz como vehículo para el 3-MI.

Exposición al olor del linalol

La exposición al olor del linalol se realizó en una cámara de olor hecha a medida. Se colocó un trozo de papel de filtro de 2 cm x 2 cm tratado con 0, 20, 200 o 2000 μl de linalol en cada una de las cuatro esquinas de una caja de acrílico (25 cm x 25 cm x 25 cm). Se colocó un ratón en una jaula de acrílico con una cubierta de red de alambre (12 cm x 20 cm x 10 cm) y se colocó en el centro de la cámara de olor. Los ratones no pudieron acceder directamente a la fuente del olor, pero estuvieron expuestos al aire oloroso. En esta cámara de olor, los ratones fueron expuestos al olor de linalool durante 30 minutos. Después de la exposición, se les realizó a los ratones una prueba de comportamiento. Para el grupo expuesto al aire inodoro, se colocó un ratón en la cámara de olor como grupo expuesto al linalol con la única excepción de que los papeles de filtro en la caja acrílica no estaban empapados con linalool. Para evitar el olor residual a linalol, utilizamos otras cámaras de olor para el grupo expuesto al aire inodoro. Todas las cajas y jaulas de acrílico se cambiaron con respecto a cada sujeto y se lavaron con agua y se limpiaron con etanol al 70% después de las sesiones diarias.

Prueba de caja clara/oscura

Para medir la ansiedad se utilizó el aparato Light/Dark box (modificado de la caja CPP, Muromachi Kikai, Tokio, Japón) ( Crawley, 1981 ). Consistía en una caja de acrílico con dos compartimentos del mismo tamaño (25 cm × 18 cm × 21 cm); un compartimento claro y un compartimento oscuro. Los dos compartimentos estaban conectados con una pequeña entrada (8 cm × 6 cm) y se extendió una lámina de plástico en el suelo de ambas cámaras. El compartimento de luz estaba iluminado por una lámpara LED con una intensidad de 400 LUX en el suelo. El compartimento oscuro estaba cubierto con una tapa negra para protegerlo de la luz. Los ratones se colocaron en el compartimento de luz de espaldas a la entrada y se registraron los comportamientos con una cámara de vídeo digital durante 5 minutos. EthoVision XT analizó los datos del vídeo para medir el tiempo transcurrido en el compartimento de luz y medir el número de entradas al compartimento de luz. Después de cada prueba, las cámaras de la caja de luz/oscuridad se lavaron con agua y se limpiaron con etanol al 70%.

Prueba de laberinto elevado más

Se utilizó el aparato de laberinto elevado en cruz (EPM-04M, Muromachi Kikai, Tokio, Japón) para medir la ansiedad ( Lister, 1987 ). Constaba de dos brazos abiertos (30 cm × 6 cm) y dos brazos cerrados con paredes laterales y finales (30 cm × 6 cm × 15 cm), y plataforma central (6 cm × 6 cm). La altura del brazo fue de 40 cm desde el suelo. La iluminación se fijó en 100 LUX en el suelo de la plataforma central. El ratón se colocó en la plataforma central frente a los brazos abiertos y se grabó en vídeo durante 5 min. EthoVision XT analizó los datos del video para medir el tiempo pasado en los brazos abiertos y el número de entradas en los brazos abiertos y la distancia total recorrida. Después de cada prueba, el laberinto se lavó con agua y se limpió con etanol al 70%.

Prueba acelerada de Rotarod

Para evaluar la coordinación motora y el equilibrio, realizamos la prueba de aceleración de rotarod ( Jones y Roberts, 1968 ) utilizando un aparato de rotarod de un solo carril (MK-630B, Muromachi Kikai, Tokio, Japón). Los ratones recibieron dos pruebas entrenadas (cada prueba continuó durante 300 s con velocidad fija (4 rpm)) con un intervalo de 30 minutos en dos días consecutivos antes de la prueba de aclimatación al aparato. El día experimental, después de 30 minutos de exposición al olor, se colocaron los ratones en la barra giratoria y la velocidad de rotación del rotarod se aumentó gradualmente de 4 rpm a 40 rpm en 300 s. Se midió el tiempo que permaneció sobre la barra giratoria ( Vincenzi et al., 2013 ).

Privación del epitelio olfativo

Para la privación olfativa, alteramos el epitelio olfativo mediante la administración intraperitoneal de 3-MI, que induce una destrucción extensa de la mucosa olfativa, lo que resulta en anosmia ( Kim et al., 2010 ). Brevemente, se administraron 300 mg/kg de 3-MI al 3% en aceite de maíz mediante inyección intraperitoneal. En el grupo de control, se administraron 10 ml/kg de aceite de maíz mediante inyección intraperitoneal. Dos semanas después de la inyección, se utilizaron ratones tratados con 3-MI para la prueba de comportamiento ( Tashiro et al., 2016 ).

Prueba de habituación/deshabituación olfativa para la anosmia

Cuando un animal huele un olor nuevo, el animal investiga el olor acercándose y oliéndolo. Con presentaciones repetidas del olor, el número de aproximaciones al olor y el tiempo empleado en oler el olor se reducen progresivamente (habituaciones). Cuando el animal se expone a un olor nuevo y detecta el nuevo olor, el animal muestra una investigación renovada.

Con base en el comportamiento innato, realizamos pruebas de habituación/deshabituación olfativa para confirmar si los ratones tratados con 3-MI eran anósmicos para el linalol ( Gregg y Thiessen, 1981 ; Guan et al., 1993 ; Luo et al., 2002 ; Woodley y Baum, 2003 ). Se colocó un ratón tratado con 3-MI en una jaula (12 cm x 20 cm x 10 cm) con una tapa de malla de alambre y se expuso a un hisopo de algodón empapado con 20 µl de agua tres veces durante 2 minutos (ensayos de habituación). y luego se expuso a un hisopo de algodón empapado con 20 μL de linalool durante 2 minutos (prueba de deshabituación). El número de acercamientos y el tiempo dedicado a olfatear el hisopo de algodón se registraron como comportamientos exploratorios. El acercamiento se definió como la acción del ratón moviendo su nariz a 10 mm del hisopo de algodón. Olfatear se definió como la acción del ratón manteniendo su nariz a 10 mm del hisopo durante al menos 1 s para oler.

Análisis de datos

Si no se especifica lo contrario, las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando ANOVA unidireccional con pruebas de comparación múltiple post hoc de Tukey utilizando el software Prism6 (GraphPad Software, Inc.). El criterio de significación estadística fue p < 0,05 en todos los casos. Después de ANOVA unidireccional o prueba t no pareada , realizamos análisis de potencia post hoc utilizando el software G*Power tres ( Faul et al., 2007 ). Los autores pondrán a disposición de cualquier investigador calificado los datos brutos que respaldan la conclusión de este manuscrito, sin reservas indebidas.

Resultados

La exposición al olor del linalool induce efectos ansiolíticos en ratones

Para examinar los efectos ansiolíticos del olor de linalol, realizamos pruebas clásicas de ansiedad inmediatamente después de que los ratones fueron expuestos al vapor de linalol (Figura 1 ). Las pruebas de caja de luz/oscuridad revelaron que la exposición al olor de linalool aumentó significativamente el comportamiento exploratorio en la cámara de luz (Figuras 1A, B ), lo que indica efectos ansiolíticos (tiempo pasado en la caja de luz: F (2,27) = 9,184, p = 0,0009, estadístico potencia = 0,9757 (ANOVA unidireccional), p control-linalol = 0,0010 (prueba de comparación múltiple de Tukey); número de entradas de caja de luz: F (2,27) = 7,317, p = 0,0029, potencia estadística = 0,9365 (unidireccional ANOVA), p control-linalol = 0,0029 (prueba de comparación múltiple de Tukey), n = 10 por grupo). Los efectos fueron comparables a los inducidos por la administración de diazepam (1,5 mg/kg, ip) (tiempo pasado en la caja de luz: p linalol-diazepam = 0,6139 (prueba de comparación múltiple de Tukey); número de entradas en la caja de luz: p linalool-diazepam = 0,6276 ). Para confirmar los efectos ansiolíticos de la exposición al olor de linalool, luego realizamos la prueba EPM (Figuras 1C, D ). Los resultados mostraron un aumento significativo de la exploración de los brazos abiertos (tiempo pasado en los brazos abiertos: F (2,27) = 12,35, p = 0,0002, poder estadístico = 0,9958 (ANOVA unidireccional), p control-linalol = 0,0416 ( prueba de comparación múltiple de Tukey); número de entradas de brazos abiertos: F (2,27) = 6,982, p = 0,0036, potencia estadística = 0,9252 (ANOVA unidireccional), p control-linalol = 0,0258 (prueba de comparación múltiple de Tukey), n = 10 por grupo), lo que nuevamente indica efectos ansiolíticos del olor a linalol. A continuación, para examinar si la exposición al olor del linalol afectaba la función motora, realizamos una prueba de aceleración del rotarod. La latencia para disminuir en el grupo expuesto al olor de linalol no fue significativamente diferente de la del grupo expuesto al aire inodoro ( t = 0,121, p = 0,906, poder estadístico = 0,05147 ( prueba t no apareada ); n control = 6, n linalol = 7), lo que sugiere que la habilidad motora coordinada no se vio afectada por la exposición al olor de linalool (Figura 1E). A partir de estos resultados, llegamos a la conclusión de que la exposición al vapor de linalool indujo efectos ansiolíticos sin deterioro motor en ratones.

Figura 1

FIGURA 1 . Efectos ansiolíticos de la inhalación de linalol y la inyección de diazepam en las pruebas de caja clara/oscura y laberinto elevado en cruz (EPM). En la prueba de la caja de luz/oscuridad, el tiempo pasado en la caja de luz (A) y el número de entradas a la caja de luz (B) aumentaron significativamente en el grupo de linalol. En la prueba EPM, el tiempo pasado en los brazos abiertos (C) y el número de entradas a los brazos abiertos (D) aumentaron significativamente en el grupo de linalol. n = 10 para todos los grupos en (A – D) . (E) Latencia para disminuir al acelerar el rotarod. n = 6 para el grupo de aire inodoro y n = 7 para el grupo de linalol. (C) Ratones expuestos al aire inodoro; L, ratones expuestos a 200 μL de olor a linalool. (D) Ratones a los que se les administró diazepam por vía intraperitoneal. Cada columna representa la media ± SEM. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001 en comparación con el grupo de control expuesto al aire inodoro ( prueba de comparación múltiple post hoc de Tukey).

A continuación, para examinar la dependencia de la dosis de los efectos ansiolíticos inducidos por el vapor de linalol, evaluamos el efecto de varias dosis de linalool mediante la prueba EPM. Los resultados indicaron que el tiempo pasado en los brazos abiertos (Figura 2A ) y el número total de entradas en los brazos abiertos (Figura 2B ) aumentaron de acuerdo con el aumento de la dosis de linalol (tiempo pasado en los brazos abiertos: F (3,36) = 10,54, p < 0,0001, potencia estadística = 0,9989 (ANOVA unidireccional), p control-linalool 200 = 0,008, p control-linalool 2000 < 0,0001, p linalool 20-linalool 2000 = 0,0020 (prueba de comparación múltiple de Tukey); número de entradas de brazos abiertos : F (3,36) = 8,797, p = 0,0002, potencia estadística = 0,9952 (ANOVA unidireccional), p control-linalool 200 = 0,0039, p control-linalool 2000 = 0,0002, p linalol 20-linalool 2000 = 0,0203 ( prueba de comparación múltiple de Tukey); n = 10 por grupo). Cabe señalar que la distancia total recorrida durante la prueba EPM no se vio afectada significativamente por la exposición al olor del linalool (Figura 2C ; F (3,36) = 1,137, p = 0,3472 (ANOVA unidireccional), poder estadístico = 0,3086; n = 10 por grupo), lo que sugiere que los efectos del olor del linalol fueron ansiolíticos en lugar de sedantes.

Figura 2

FIGURA 2 . Dependencia de la dosis de los efectos ansiolíticos de la exposición al olor de linalool. El tiempo transcurrido en los brazos abiertos (A) y el número de entradas a los brazos abiertos (B) indican que los efectos ansiolíticos dependían de la concentración de linalool. (C) La actividad locomotora espontánea no se vio afectada por la exposición al olor del linalol. Las distancias totales recorridas durante 5 min en el EPM no variaron significativamente. Control, ratones expuestos a ratones inodoros expuestos al aire; Linalool 20, ratones expuestos a 20 μL de linalool; Linalool 200, ratones expuestos a 200 μL de linalol; Linalool 2000, ratones expuestos a 2000 μL de linalool; n = 10 para todos los grupos. Los resultados se expresan como media ± SEM. ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001 en comparación con el grupo de control. # P < 0,05, ## P < 0,01 en comparación con el grupo Lin 20 ( prueba de comparación múltiple post hoc de Tukey).

Los efectos ansiolíticos inducidos por el vapor de linalol fueron desencadenados por la entrada olfativa

Para examinar si los efectos ansiolíticos fueron desencadenados por la entrada olfativa provocada por la exposición al olor de linalol, evaluamos los efectos en ratones anósmicos (Figura 3 ). En ratones anósmicos a los que se administró 3-MI, los efectos ansiolíticos inducidos por el olor de linalol no se observaron en la prueba de caja clara/oscura (Figuras 3A, B ; tiempo pasado en la caja luminosa: F (3,36) = 12,75, p < 0,0001 ( ANOVA unidireccional), poder estadístico = 0,9998; p (3MI/control-3MI/linalool) = 0,9994 (prueba de comparación múltiple de Tukey); número de entradas de la caja de luz: F (3,36) = 10,67, p < 0,0001 (uno ANOVA de dos vías), poder estadístico = 0,9990; p (3MI/control-3MI/linalool) = 0,9093 (prueba de comparación múltiple de Tukey)) y la prueba EPM (Figuras 3C,D ; tiempo pasado en brazos abiertos: F (3,36 ) = 8,794, p = 0,0002 (ANOVA unidireccional), poder estadístico = 0,9952; p (3MI/control-3MI/linalool) = 0,9994 (prueba de comparación múltiple de Tukey); número de entradas de brazos abiertos: F (3,36) = 8,827, p = 0,0002 (ANOVA unidireccional), poder estadístico = 0,9953; p (3MI/control-3MI/linalool) = 0,8035 (prueba de comparación múltiple de Tukey); n = 10 por grupo). Después de las pruebas de ansiedad, asignamos 10 ratones 3-MI y 10 ratones a los que se les administró vehículo a la prueba de habituación/deshabituación olfativa. El resultado mostró que no se observaron comportamientos exploratorios hacia el olor de linalol en ratones 3-MI, lo que indica que los ratones tratados con 3-MI no pudieron detectar el olor de linalol l (Figuras 4A, B ; número de aproximaciones a la fuente de olor: F 3MI tratamiento (1,18) = 1.132, p 3MI tratamiento = 0.3014; F olor (3,54) = 36.75, p olor < 0.0001; F interacción (3,54) = 19.26, p interacción < 0.0001 (dos mediciones repetidas) way ANOVA); p linalool/VEH-linalool/3MI < 0,0001 (prueba de comparación múltiple de Bonferroni); tiempo dedicado a olfatear la fuente del olor: F tratamiento 3MI (1,18) = 5,400, p tratamiento 3MI = 0,0320; F olor (3 ,54) = 18.09, p olor < 0.0001; F interacción (3,54) = 7.817, p interacción= 0,0002 (ANOVA bidireccional medido repetidamente), p linalool/VEH-linalol/3MI < 0,0001 (prueba de comparación múltiple de Bonferroni), n = 10 por grupo).

Figura 3

FIGURA 3 . El aporte olfativo fue esencial para los efectos ansiolíticos inducidos por la exposición al linalol. El aumento en el tiempo pasado en la caja de luz (A) y en el número de entradas a la caja de luz (B) por la exposición al olor de linalol no se observó en ratones anósmicos como resultado del tratamiento con 3-metilindol (3-MI). El aumento en el tiempo pasado en los brazos abiertos (C) y el número de entradas a los brazos abiertos (D) no se observaron en los ratones anósmicos. Control, ratones expuestos a aire inodoro; Linalol, ratones expuestos a 200 μL de linalool; VEH, ratones a los que se les administró vehículo (aceite de maíz, ip); 3-MI, ratones a los que se les administró 3-MI (300 mg/kg, ip); n = 10 para todos los grupos; cada columna representa la media ± SEM. *** P < 0,001, **** P < 0,0001 en comparación con el grupo de control inyectado con vehículo, ## P < 0,01, ### P < 0,001, #### P < 0,0001 en comparación con el linalool inyectado con 3-MI grupo ( prueba de comparación múltiple post hoc de Tukey).

Figura 4

FIGURA 4 . Confirmación de la privación olfativa causada por la administración de 3-MI en la prueba de habituación/deshabituación olfativa. El número de enfoques (A) y el tiempo dedicado a olfatear (B) el hisopo de algodón empapado en agua no fueron diferentes entre los ratones tratados con vehículo y los tratados con 3-MI, pero ambos con el hisopo de algodón empapado en linalol disminuyeron significativamente en los ratones anósmicos tratados con 3-MI. ratones. VEH, ratones a los que se les administró vehículo (aceite de maíz, ip); 3-MI, ratones a los que se les administró 3-MI (300 mg/kg, ip); Agua, agua destilada (200 μL); Linalol, Linalol (200 μL). n = 10 para todos los grupos. Los resultados se expresan como media ± SEM. **** P < 0,0001 ( prueba de comparación múltiple post hoc de Bonferronie).

El sistema GABAérgico media los efectos ansiolíticos inducidos por el olor del linalool

Los efectos beneficiosos de las BDZ y las azapironas en el tratamiento de los trastornos de ansiedad indican la participación de GABA A R y 5-HT 1A R que responden a BDZ. Para evaluar si esos receptores estaban involucrados en los efectos ansiolíticos inducidos por el olor de linalol, realizamos la prueba EPM para examinar los efectos ansiolíticos inducidos por el olor de linalol, pero administramos flumazenil (antagonista del sitio BDZ de GABA A R) o WAY100635 (5- antagonista HT 1A R) antes de la prueba (Figura 5 ). El tratamiento previo con flumazenil eliminó por completo los efectos ansiolíticos del olor de linalool, lo que indica que la transmisión GABAérgica a través de GABA A R sensibles a BDZ fue esencial para los efectos ansiolíticos (tiempo pasado en brazos abiertos: F (5, 54) = 10,70, p < 0,0001 (uno ANOVA de dos vías), poder estadístico = 0,9999, p linalool/VEH-linalool/Gripe = 0,0001, p control/Gripe-linalool/Gripe = 0,9995 (prueba de comparación múltiple de Tukey); número de entradas de brazos abiertos: F (5,54) = 8,966, p < 0,0001 (ANOVA unidireccional), poder estadístico = 0,9999, p linalool/VEH-linalool/Gripe = 0,0002, p control/Gripe-linalool/Gripe = 0,7239 (prueba de comparación múltiple de Tukey); n = 10 por grupo). Por el contrario, el tratamiento con WAY100635 no indujo cambios significativos en los efectos ansiolíticos del olor a linalool (tiempo pasado en brazos abiertos: p linalool/VEH-linalool/WAY = 0,7374, p control/WAY-linalool/WAY = 0,0032 (prueba de comparación múltiple de Tukey) ; número de entradas de brazos abiertos: p linalool/VEH-linalool/WAY = 0,9895, p control/WAY-linalool/WAY = 0,0086 (prueba de comparación múltiple de Tukey), lo que sugiere que la transmisión serotoninérgica a través de 5-HT 1A R puede no estar involucrada en los efectos.

Figura 5

FIGURA 5 . Influencia del pretratamiento con flumazenil o WAY100635 sobre los efectos ansiolíticos del linalol. El aumento en el tiempo pasado en los brazos abiertos (A) y el número de entradas a los brazos abiertos (B) debido a la exposición al olor de linalol se eliminaron en ratones tratados con flumazenil, pero no con WAY100635 en los efectos ansiolíticos inducidos por el olor de linalol. El tratamiento previo con flumazenil o WAY100635 sin exposición al olor de linalol no afectó las conductas exploratorias. Control, ratones expuestos a aire inodoro; Linalol, ratones expuestos a 200 μL de linalool; VEH; a los ratones se les administró vehículo (Tween80 al 2% en solución salina); Gripe, a los ratones se les administró flumazenil (3 mg/kg ip); WAY, ratones a los que se les administró WAY100635 (0,5 mg/kg ip); cada columna representa la media ± SEM; n = 10 para todos los grupos. ** P < 0,01, **** P < 0,0001 en comparación con el grupo Control + VEH, ### P < 0,001 en comparación con Linalool + Flu, $$ P < 0,01 en comparación con Control + WAY ( múltiplo de Tukey post hoc prueba de comparación).

Discusión

Limitaciones técnicas de este estudio

En este estudio, mostramos los efectos ansiolíticos inducidos por el olor del linalol sólo en ratones machos adultos. Para tener una comprensión general del fenómeno, necesitamos además evaluar los efectos en las hembras (para examinar las diferencias de sexo) y en ratones más jóvenes/mayores (para examinar la dependencia de la edad).

Entrada olfativa provocada por efectos ansiolíticos inducidos por el olor del linalol

En este estudio, encontramos que la exposición al olor de linalool indujo efectos ansiolíticos en ratones (Figura 1 ). Los efectos no se observaron en ratones anósmicos (Figura 4 ), lo que indica que los efectos fueron desencadenados por la entrada olfativa provocada por la exposición al olor de linalol. Anteriormente, varios estudios han examinado que la inhalación de linalol inducía efectos ansiolíticos ( Linck et al., 2010 ; Takahashi et al., 2011 ; Zhang et al., 2016 ). Sin embargo, debido a que la contribución del sistema olfativo no se examinó directamente, no se reveló la naturaleza de cómo el linalol puede inducir los efectos. En este estudio, confirmamos que el sistema olfativo era esencial para los efectos ansiolíticos inducidos por el olor del linalol utilizando ratones anósmicos (Figuras 3 , 4 ). Por lo tanto, establecimos que la entrada olfativa provocada por el olor a linalol era responsable de inducir los efectos ansiolíticos.

Además del linalool, también se ha informado que otros olores inducen efectos ansiolíticos cuando se inhalan. Por ejemplo, la inhalación de (+)-limoneno Lima et al. (2013) , óxido de linalol Souto-Maior et al. (2011) o α-pineno ( Satou et al., 2014 ) demostraron reducir la ansiedad en ratones. En estos estudios, los autores no abordaron la contribución de la entrada olfativa a los efectos ansiolíticos. Sin embargo, la inhalación de estos compuestos olorosos puede desencadenar los efectos ansiolíticos a través del olfato. Es de destacar que los efectos resultantes de la inhalación de limoneno no fueron antagonizados por el tratamiento previo con flumazenil ( Lima et al., 2013 ). En conjunto con nuestros resultados, es posible que haya al menos dos vías ansiolíticas paralelas que involucren sistemas dependientes e independientes de GABA AR que responden a BDZ evocados por la entrada olfativa .

Debido al hecho de que un receptor de olor determinado es activado por una variedad de moléculas de olor con estructuras similares ( Malnic et al., 1999 ), una variedad de moléculas de olor también pueden desencadenar circuitos neuronales centrales específicos necesarios para la acción ansiolítica inducida por linalool. efectos. Para análisis adicionales, sería beneficioso identificar los receptores de olores que contribuyen a los efectos ansiolíticos inducidos por el olor y un estudio sistemático de los olores que actúan sobre los receptores. Además de los receptores de olores, el linalol también afecta los canales de calcio de tipo T (TTCC) ( El Alaoui et al., 2017 ). Debido a que los TTCC contribuyen a la generación de potenciales de acción en las neuronas sensoriales olfativas ( Kawai et al., 1996 ), la modulación de los TTCC por el linalol también puede contribuir a la analgesia inducida por el olor del linalol.

Varios estudios han informado previamente que la administración sistémica de linalool por vía intraperitoneal ( Umezu et al., 2006 ; Coelho et al., 2011 ; Guzman-Gutiérrez et al., 2012 ) u oral ( Cheng et al., 2015 ) indujo efectos ansiolíticos. En estos estudios, no se abordaron los principales sitios afectados por el linalol. Sin embargo, se ha asumido que el linalol que ingresa al torrente sanguíneo mediante absorción a través de las vías respiratorias puede modular la neurotransmisión glutamatérgica ( Elisabetsky et al., 1995 ; Batista et al., 2008 ). Otra posibilidad planteada por nuestros resultados es que el linalool administrado sistémicamente puede emitirse en el aliento exhalado e impulsar los efectos ansiolíticos a través del sistema olfativo por vía retronasal ( Kikuta et al., 2016 ).

Circuitos neuronales subyacentes a los efectos ansiolíticos inducidos por el olor del linalool

En este estudio, demostramos que la administración de flumazenil eliminó por completo los efectos ansiolíticos inducidos por el olor del linalol (Figura 5 ). Flumazenil bloquea los efectos ansiolíticos inducidos por GABA antagonizando el sitio BDZ de α2-GABA AR ( Rudolph et al., 1999 ; Low et al., 2000 ). Debido a que ya no había efectos ansiolíticos por el olor de linalol cuando se utilizaron ratones privados de olfato (Figura 3 ), los efectos pueden no ser provocados por la activación directa de los sitios BDZ con linalool, sino más bien por la activación de circuitos ansiolíticos intrínsecos que involucran la transmisión GABAérgica a través de BDZ- sensible GABA A R.

En contraste con el antagonismo del flumazenil, el antagonista 5-HT 1A R WAY100635 no mostró ningún cambio significativo en los efectos ansiolíticos inducidos por el olor del linalool (Figura 5B ). Los estudios clínicos y preclínicos han indicado que el sistema serotoninérgico, que incluye 5-HT 1A R, también desempeña un papel clave en la modulación de la ansiedad y es uno de los principales objetivos del tratamiento clínico ( Gordon y Hen, 2004 ; Albert et al., 2014 ). Por otro lado, nuestros hallazgos sugieren que la transmisión serotoninérgica a través de 5-HT 1A R puede no estar involucrada en los efectos ansiolíticos inducidos por el olor a linalool.

En resumen, encontramos que la exposición al olor del linalol indujo efectos ansiolíticos sin deterioro motor en ratones. Los efectos fueron abolidos en ratones anósmicos, lo que indica que la entrada olfativa provocada por el olor del linalool era necesaria para desencadenar los efectos. Además, la transmisión sináptica con GABA A R sensibles a BDZ también fue esencial para los efectos. Estos hallazgos nos dan una base para la aplicación clínica del olor a linalol para los trastornos de ansiedad. Además, los efectos ansiolíticos inducidos por el olor del linalool pueden ser aplicables para pacientes preoperatorios porque el tratamiento previo con ansiolíticos puede aliviar el estrés preoperatorio y así contribuir a colocar a los pacientes bajo anestesia general más suavemente. Además, para los pacientes que pueden tener dificultades con la administración de ansiolíticos orales o en supositorios, como los bebés, utilizar el olor a linalol para ayudar a reducir la ansiedad puede ser una alternativa conveniente y prometedora.

Contribuciones de autor

HH, TK y HK diseñaron el estudio. HH y HK realizaron el estudio y analizaron los datos. HH, YK, TK y HK escribieron el artículo. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Fondos

Este trabajo fue apoyado por la subvención KAKENHI número 17K01988 (HK) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS).

Declaracion de conflicto de interes

Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un potencial conflicto de intereses.

Expresiones de gratitud

Agradecemos al Sr. J. Pauli por la edición en inglés, a la Sra. Y. Ueno por la asistencia técnica, al Prof. T. Kurihara por sus sugerencias críticas sobre las pruebas de ansiedad y a los miembros del Departamento de Fisiología y Anestesiología por su útil discusión. También agradecemos al Laboratorio Conjunto de Investigación y al Laboratorio de Ciencia Animal de la Escuela de Graduados en Ciencias Médicas y Dentales de la Universidad de Kagoshima por el uso de sus instalaciones.

Referencias

Albert, PR, Vahid-Ansari, F. y Luckhart, C. (2014). Circuito cortical prefrontal de serotonina en fenotipos de ansiedad y depresión: papel fundamental de la expresión del receptor 5-HT 1A pre y postsináptico . Frente. Comportamiento. Neurociencias. 8:199. doi: 10.3389/fnbeh.2014.00199